PRÁCTICA 7

 PRÁCTICA 7                                           

PARTE 1:                                                                    11/01/22

CUANTIFICACIÓN DE HEMOGLOBINA A2

OBJETIVOS
Obtener la concentración de hemoglobina A2 de una muestra.

FUNDAMENTO
Ya preparado el hemolizado, las hemoglobinas quedarán retenidas en la resina de la columna por intercambio iónico. La hemoglobina A2 se eluye de forma específica bajo estrictas condiciones de pH y fuerza iónica, después cuantificaremos en el espectrofotómetro por lectura a 415nm.

MATERIALES
-Reactivo
-Columnas
-Sangre anticoagulada
-Micropipetas
-Pipetas
-Puntas de pipeta
-Tubos de ensayo
-Vaso de precipitados
-Eppendorf
-Cubetas de espectrofotómetro

PROCEDIMIENTO
1-Preparamos el hemolizado con 50 microlitros de sangre y 200 microlitros de agua destilada.
2-Destapamos la parte superior de la columna, rompemos la lengüeta inferior y bajamos el disco superior hasta el nivel de la resina con la ayuda de una pipeta. Dejamos gotear el líquido y desechamos.
3-Aplicamos sobre el disco 50 microlitros del hemolizado, desechamos el eluido.
4-Cuando haya penetrado el hemolizado, añadimos 200 microlitros de reactivo y desechamos el eluido.
5-Colocamos la columna sobre un tubo de ensayo nuevo y añadimos 3mL de reactivo, recogemos este eluido que contiene la fracción de hemoglobina A2 que buscamos. 
6- Leemos la absorbancia de la hemoglobina en el espectrofotómetro a 415nm frente a agua destilada.
7-Para la hemoglobina total pipeteamos 12mL de agua destilada y añadimos 50 microlitros del hemolizado.
8-Agitamos y medimos la absorbancia a 415nm frente a agua destilada.

  

RESULTADOS
La lectura a 415nm fue de :
Hb total= 0,497
HbA2= 0'056

El porcentaje de HbA2 en la muestra:
A HbA2/ AHbtotal X 25=  2'8% de hemoglobina A2 en sangre, estando entre los valores de referencia, 1,3-3,7%.

La disminución de las cadenas globínicas beta, que forman parte de la estructura de la hemoglobina A, caracteriza la hemoglobinopatia hereditaria beta-talasemia. La concentración de hemoglobina A2 en sangre se encuentra elevada ya que se produce una síntesis de hemoglobinas no constituidas por cadenas beta. Deben tenerse en cuenta más pruebas para determinar el diagnóstico.

OBSERVACIONES
El resultado fue bueno a pesar de tener la sangre más coagulada de lo normal por falta de sangre reciente.

 PARTE 2:

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE HIERRO EN PLASMA

OBJETIVOS
Cuantificar la concentración de hierro en sangre.

FUNDAMENTO
El hierro constituye un gran número de enzimas, para la producción de hemoglobina es necesario ya que ésta molécula es la transportadora del oxígeno en el interior de los glóbulos rojos. Su déficit causa la anemia ferropénica.
Se encuentran niveles elevados de hierro en la hemocromatosis, cirrosis, hepatitis aguda y en concentraciones altas de transferrina.

MATERIALES
-Reactivo 1 tampón
-Reactivo 2 reductor
-Reactivo 3 color
-Patrón
-Suero o plasma heparinizado
-Pipetas
-Micropipetas
-Eppendorf
-Cubetas de espectrofotómetro

PROCEDIMIENTO
1-Preparar el reactivo de trabajo (RT) disolviendo el contenido de R2 reductor en un frasco de R1 tampón.
2-Preparamos 4 Eppendorf con las siguientes mezclas:
·Blanco de reactivo: 1mL RT+ 1 gota R3+ 200microlitros agua destilada
·Patrón: 1mL RT + 1 gota R3 + 200microlitros patrón 
·Blanco de muestra: 1mL de RT + 200 microlitros de muestra
·Muestra: 1mL de RT+ 1 gota R3 + 200microlitros de muestra
3- Mezclamos e incubamos 5 minutos a 37ºC o 10 min a temperatura ambiente.
4- Medimos en el espectrofotómetro a 562nm, primero ajustamos a  cero frente a agua destilada.
5- Realizamos las lecturas de las absorbancias.

RESULTADOS
Amuestra-Ablanco muestra/ Apatrón x 100=  0'123- 0'089/0'071 x 100= 47'88mg/dL

Resultado de la muestra: 47,88mg/dL
Valores de referencia:
hombres 65-175 microgramos/dL
mujeres 40-150 microgramos/dL


OBSERVACIONES
Entra dentro del rango de normalidad de la muestra en mujeres, repetimos la práctica y finalmente hemos obtenido este resultado.


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